¿Qué es HPLC? - Conoce esta técnica utilizada en química

La cromatografía líquida de alto rendimiento, conocida como HPLC por sus siglas en inglés, se erige como una herramienta analítica de gran potencia. Se trata de una técnica ampliamente empleada en un laboratorio para separar, identificar y cuantificar las diversas sustancias presentes en una mezcla.

Este método de gran sofisticación desempeña un papel fundamental en múltiples campos de la química, permitiendo a los científicos sumergirse en la composición de mezclas complejas con una precisión sin igual. En esta publicación, te mostramos qué es la HPLC, explorando sus componentes esenciales, los procedimientos involucrados y las amplias aplicaciones que abarca.

¿Para qué sirve el HPLC?

La HPLC es una herramienta indispensable en la química analítica moderna. Esta técnica permite separar y analizar sustancias disueltas en un líquido. Por ejemplo, fármacos, aditivos alimentarios, contaminantes medioambientales, moléculas biológicas y más. Este método tiene muchas aplicaciones en diferentes campos de la ciencia y la industria. Algunos de los usos comunes de la HPLC son:

• El análisis farmacéutico: La HPLC puede comprobar la pureza, potencia y estabilidad de los fármacos y sus metabolitos. También puede detectar impurezas, contaminantes y adulterantes en productos farmacéuticos.
• La investigación biomédica: esta técnica permite medir los niveles de hormonas, proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas en muestras biológicas. También puede estudiar las interacciones y funciones de estas moléculas en diversos procesos biológicos.
• El control medioambiental: gracias a la HPLC es posible detectar y cuantificar la presencia de pesticidas, herbicidas, metales pesados, contaminantes orgánicos y otras sustancias nocivas. Las muestras a utilizar pueden ser de agua, suelo, aire y alimentos.
• El análisis de alimentos y bebidas: la aplicación de esta técnica permite determinar la calidad, seguridad y autenticidad de alimentos y bebidas. Además, puede medir el contenido de nutrientes, aditivos, conservantes, sabores, colores y otros ingredientes productos de consumo alimentario.

¿Cuáles son los componentes del HPLC?

Los sistemas HPLC constan de varios componentes esenciales que trabajan en armonía para ejecutar la separación y el análisis de mezclas. Estos componentes incluyen:

• Fase móvil: se refiere al disolvente o mezcla de disolventes que transporta la muestra a través del sistema cromatográfico.
• Depósito de disolvente: es donde se almacena la fase móvil o el disolvente. La fase móvil suele ser una mezcla de agua y disolventes orgánicos que pueden disolver los analitos.
• Inyección de la muestra: la mezcla a analizar se introduce en el sistema a través de un puerto de inyección. Esto puede hacerse manualmente o utilizando un automuestreador.
• Columna: es el corazón de la separación cromatográfica. Este componente contiene una fase estacionaria que interactúa con los compuestos de la muestra, haciendo que se separen en función de sus propiedades.
• Bomba: suministra la fase móvil al sistema a un caudal constante, garantizando resultados fiables y reproducibles. La bomba puede ser isocrática o de gradiente. La bomba isocrática suministra una única composición de fase móvil durante todo el análisis. La bomba de gradiente cambia la composición de la fase móvil durante el análisis para mejorar la separación.
• Detector: este componente controla los compuestos separados a medida que eluyen de la columna. Su función es generar las señales que se utilizan para crear un cromatograma.
• Sistema de datos: este elemento se encarga de recoger, procesar y analizar los datos aportados por el detector para producir resultados útiles y significativos.

¿Cómo se hace el HPLC?

La cromatografía líquida de alto rendimiento es una sofisticada técnica analítica que implica una serie de pasos para separar y analizar mezclas complejas. El proceso requiere de instrumentos precisos y una manipulación cuidadosa de diversos componentes. A continuación, repasamos los elementos básicos de la HPLC.

Instrumentación HPLC

La instrumentación de HPLC abarca un sistema meticulosamente diseñado de componentes interconectados que facilitan la separación y el análisis de mezclas complejas. En su núcleo se encuentra la columna, que alberga la fase estacionaria donde los compuestos experimentan interacciones selectivas basadas en sus propiedades únicas.

La fase móvil, almacenada en un depósito e impulsada por una bomba de precisión, transporta la muestra a través de la columna a una presión elevada, garantizando un caudal controlado. A medida que los compuestos separados salen de la columna, un detector sensible registra su presencia y concentración. En base a esa información genera señales que son procesadas por el sistema de datos.

Esta intrincada interacción permite a los científicos desvelar la compleja composición de las sustancias con una precisión y reproducibilidad inigualables.

Separación de mezclas

El objetivo principal de la HPLC es separar una mezcla en sus componentes individuales, lo que permite su identificación y cuantificación. Esta separación se consigue aprovechando las distintas interacciones entre los compuestos de la muestra y la fase estacionaria de la columna. A continuación detallamos cómo se desarrolla el proceso de separación:

• Inyección de la muestra: el proceso comienza con la inyección de un pequeño volumen de la mezcla de la muestra en el sistema. La inyección se controla cuidadosamente para garantizar resultados precisos y reproducibles.
• Flujo de la fase móvil: la bomba suministra la fase móvil, transportando la muestra a través de la columna a alta presión. La muestra interactúa con la fase estacionaria, y los compuestos con diferentes afinidades por la fase estacionaria experimentan diferentes velocidades de interacción.
• Separación de compuestos: mientras la muestra recorre la columna, los compuestos se separan en función de factores como el tamaño, la carga, la polaridad, etcétera. Estas diferencias de interacción hacen que los compuestos eluyan de la columna en tiempos diferentes (es decir, sean liberados en momentos distintos).
• Detección y generación de cromatogramas: a medida que los compuestos eluyen de la columna, pasan por el detector, que registra su presencia y concentración. El sistema de datos procesa esta información y genera un cromatograma. Cada compuesto separado aparece como un pico, y su tiempo de retención proporciona información sobre su identidad y comportamiento.

En esencia, la HPLC consigue la separación aprovechando las diversas propiedades de los componentes de una mezcla. Esto convierte a la HPLC en una potente herramienta para analizar muestras complejas en diversas aplicaciones científicas e industriales.

¿Qué es un cromatograma en HPLC?

Un cromatograma es el resultado generado por el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento. Básicamente, se trata de una representación gráfica de los datos obtenidos por el análisis HPLC.

En esencia, esta representación gráfica captura la intrincada danza de las moléculas a medida que navegan por el sistema cromatográfico, proporcionando a los científicos una representación visual y cuantitativa de la composición de la muestra.

Esta representación gráfica muestra la intensidad de la señal del detector a lo largo del tiempo. En el cromatograma cada compuesto separado aparece como un pico distinto. Un pico es una curva que muestra cómo eluye de la columna uno un grupo de analitos (sustancia de interés en un análisis químico). Un pico tiene varias características, incluyendo:

• Tiempo de retención: es el tiempo o volumen en el que un analito alcanza su máxima señal o respuesta en un cromatograma. El tiempo de retención se utiliza para identificar un analito basándose en su interacción con la fase estacionaria.
• Área del pico: es el área bajo un pico mostrado en un cromatograma. Se utiliza para cuantificar un analito en función de su concentración en la muestra.
• Altura del pico: es la señal o respuesta máxima de un pico en un cromatograma. Esta propiedad permite cuantificar un analito en función de su concentración en la muestra.
• Anchura de pico: se refiere a la anchura de un pico en su base o en la mitad de su altura. La anchura del pico se utiliza para medir la eficacia de una separación basándose en lo bien que se separa un analito de otros analitos.
• Forma del pico: esta característica permite evaluar la calidad de una separación en función de la simetría, la nitidez o las colas de un pico.

El cromatograma consta de dos ejes:

• El eje X representa el tiempo, reflejando el recorrido de la muestra a través de la columna cromatográfica. A medida que los diferentes compuestos se desplazan por la columna, debido a sus interacciones con la fase estacionaria, emergen en distintos momentos del tiempo, creando picos separados en el cromatograma.
• El eje Y corresponde a la intensidad de la señal detectada por el detector del instrumento. La altura o el área de cada pico se correlacionan directamente con la concentración del compuesto responsable de ese pico. Cuanto más alto o grande sea el pico, mayor será la concentración del compuesto correspondiente en la mezcla

¿Qué se puede determinar con un cromatograma de HPLC?

Un cromatograma de HPLC contiene una gran cantidad de información sobre la mezcla analizada. Por medio del análisis de esta representación gráfica, los científicos pueden:

• Identificar compuestos: un analito puede identificarse comparando su tiempo de retención con el de un compuesto estándar o de referencia conocido en condiciones idénticas. Cuanto más parecidos sean sus tiempos de retención, más probable es que sean idénticos.
• Cuantificar sustancias: al medir el área y la altura del pico y compararla con la de un patrón o compuesto de referencia se puede cuantificar un analito. Cuanto más similares sean sus áreas o alturas de pico, más probable es que tengan concentraciones similares.
• Comparar muestras: los cromatogramas también sirven como base de comparación. los analistas pueden superponer las gráficas de diferentes muestras, y con ello identificar similitudes y diferencias en sus composiciones.
• Evaluar la pureza: la pureza de un analito puede evaluarse examinando la forma y el número de picos en un cromatograma. Cuanto más simétrico, nítido y con un solo pico sea un analito, más probable es que sea puro.
• Detectar impurezas: para detectar impurezas en un analito se buscan picos y aristas adicionales en un cromatograma. Cuantos más picos o aristas tenga un analito, más probable es que contenga impurezas.
• Reconocer degradación: comprobando los cambios en los picos se puede controlar la degradación de un analito. Cuantos más cambios muestre un analito, más probable es que se haya degradado.

Los cromatogramas encierran un tesoro de información para analistas e investigadores. Estudiando la posición, la forma, la altura y el área de los picos, los científicos pueden conocer la identidad y la cantidad de los compuestos presentes en la muestra.

Esta información es vital para diversas aplicaciones, desde el control de calidad de productos farmacéuticos hasta la evaluación de la pureza de productos alimentarios.